微囊藻素( 六 )


微囊藻素

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微囊藻毒素色谱HPLC可以对MC进行定性和定量,是了解MC化学性质甚至结构的重要手段,但是它对高纯度标準品高度依赖,而由于技术的限制,商业用标準品又非常有限,这就限制了HPLC测定MC的发展 。液质联用法(LC-MS)以液相色谱为分离系统,质谱为检测系统 。MC样品在质谱部分和流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器得到质谱图 。所以只要知道相对分子质量,就可以对样品进行精确的定量检测 。1990年,LC/MS 技术首次被套用于蓝藻毒素的检测 。HPLC-电喷雾电离质谱法(HPLC-ESI-MS)是带有电喷雾离子化系统的质谱分析法 。其大致原理是MC样品溶液在强电场的作用下破碎成许多细小的带有电荷的液滴,解吸出离子,离子碰撞活化裂解成碎片,从而获得分子的结构信息,样品的分子离子和裂片离子经一系列分离器和静电透镜进入质量分析器进行质谱分析 。1993年开始使用此方法检测MC 。四极桿质谱由四根带有直流电压(DC)和叠加的射频电压(RF)的準确平行桿构成,相对的一对电极是等电位的,两对电极之间电位相反 。当一组质荷比不同的离子进入由DC和RF组成的电场时,只有满足特定条件的离子稳定振荡通过四极桿,到达监测器而被检测 。通过扫RF场可以获得质谱图 。四极桿成本低,价格便宜,虽然日常分析的质荷比的範围只能达到3000,但由于分析器内部可容许较高压力,很适合在大气压条件下产生离子的ESI离子化方式,并且,ESI电离最突出特点是产生多电荷,MC电喷雾电离所产生的电荷分布在3000以下,所以四极桿广泛地与ESI联用,另外,三重四极桿由于可以做多级质谱,检出定量限(LOQ)为10pg,满足了低含量MC样品的检测要求 。离子肼质谱是利用离子肼作为分析器的质谱方法 。离子肼(Ion trap)由一对环形电极和两个呈双曲面形的端盖电极组成 。在环形电极上加射频电压或再加直流电压,上下两个端盖电极接地 。逐渐增大射频电压的最高值,离子进入不稳定区,由端盖极上的小孔排出 。因此,当射频电压的最高值逐渐增高时,质荷比从小到大的离子逐次排除并被记录而获得质谱图 。离子肼质谱可以很方便的进行多级质谱分析,对于物质结构的鉴定非常有用 。Zweigenbaum JA等人採用离子肼质谱对MC-LR、RR等进行质谱碎裂机理的研究,採用LC 柱富集技术,经切换阀将MC通入质谱,最后採用多级离子肼质谱对其母离子和碎片离子进行碎片断裂分析 。微囊藻素质谱图册参考资料 。飞行时间质谱根据相同能量的离子质量不同时速度不同的原理,使用电子电离源,施加脉冲拉出电压,再经加速极加快离子速度后进入无场区漂移管 。不同质量的离子则以不同的时间通过相同的漂移距离到达接收器 。飞行时间质谱扫描速度快,灵敏度高,此设备结构简单,不受质量範围限制 。Pasquale Ferranti等首次运用高效液相/电喷雾-四极桿飞行时间串联质谱法(HPLC/ESI-Q-TOF-MS/MS)测定淡水中的MC-RR、-LR、-YR、-LW和-LF,其检出定量限(LOQ)均达到0.1μg/L 。使用基质辅助雷射解吸电离飞行时间串联质谱法(MALDI-TOF-MS/MS)和离子肼串联质谱法(Ion trap-MS/MS)同时检测从而比较检测结果,结果证明HPLC/ESI-Q-TOF-MS/MS检测淡水中MC具有更高的灵敏度、选择性和重複性 。
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微囊藻素异构体HPLC-MS图超高效液相色谱是分离科学中的一个全新类别,UPLC藉助于HPLC的理论及原理,涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术,增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量 。与传统的HPLC相比,UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍 。Jing Wang等运用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测浙江省地表水中的MC-LR、-RR、-LW和-LF,回收率为91.7%~111%,RSD7.9% ~12%,检出定量限(LOQ)为2.5ng/L,6.0 ng/L,2.5ng/L和1.3ng/L 。传统的液相色谱分离这四种MC需要30min,而UPLC只需要3min;Stuart A.Oehrle等运用UPLC-MS/MS检测淡水中的7种MC也只用了8 min,其HPLC检测需要35 min 。免疫化学法利用微囊藻毒素诱发免疫反应产生抗体,利用抗体对抗原的特异性识别来对各种毒素进行检测 。以免疫技术为基础,微囊藻毒素的免疫化学法包括酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、免疫亲和色谱法、胶体金法及免疫感测器法等 。这类方法灵敏度较高、样品处理简单,便于操作,其检测限低于WHO水平,被认为是较有发展前景的方法 。自20世纪80年代末Kifir、Brooks等分别报导了对藻类毒素的单克隆抗体和多克隆抗体以后,酶联免疫吸附技术(ELISA)开始用于MCs的分析 。该技术具有较高的灵敏度、快捷的分析速度等优点 。直接竞争ELISA方法其原理是将抗藻毒素抗体包被在多孔板上,被检样品、MC-LR标準品与标记有过氧化物酶的MC-LR竞争性结合多孔板上的抗体,过氧化物酶催化底物产生的颜色与MC-LR的浓度成反比,即深色表明MC-LR浓度低,浅色表示MC-LR浓度高 。也有将MC-LR牛血清白蛋白包被在多孔板上,利用第一抗体和带标记的抗体而建立的间接竞争ELISA方法 。间接竞争ELISA比直接竞争ELISA方法灵敏度略高 。蛋白磷酸酶法可以反映各种毒素的总量,具有检测灵敏度高、测定时间较短等优点 。Serres等让未标记的被测毒素和经放射性标记的MC-YR一起与蛋白磷酸脂酶2A(PP2A)进行竞争结合,达到平衡后进行凝胶过滤,使与PP2A结合的毒素和未与PP2A结合的毒素分离,然后检测收集到的待测125I-MC-YR-PP2A的放射性 。根据用B/(Bo-B)(Bo为无毒素时125I-MC-YR的放射性,B为有标準毒素或待测毒素时125I-MC-YR的放射性)和标準毒素的浓度得到的标準曲线即可求出待测毒素的量 。Wong等探索了利用比色法筛选水体中的MCs,试验中以P-硝基苯酚为底物,监测黄色产物P-硝基酚的生成速率以表示蛋白磷酸酶2A的活性 。结果表明,比色法蛋白磷酸酶抑制分析是一种简便、便宜的筛选水体中具有肿瘤促进特性的MCs的工具 。去除技术生物法生物方法是一种清洁环保的处理方法,利用生物降解转化微囊藻毒素已经成为去除微囊藻毒素的主要途径之一 。微囊藻毒素降解的主要突破点在微囊藻毒素分子结构中不稳定基团ADDA,这个基团上的双键容易被一些微生物降解而将毒性去除 。自然界中存在这类微生物,但自然降解过程十分缓慢 。将这类微生物从自然界中提取出来为微囊藻毒素的生物去除提供了条件 。自1994年Jone等首次从水体中提取出藻毒素的降解菌后,关于藻毒素高效菌种和降解机理的研究就成为国内外专家的研究热点 。Park等从富营养化水体中提取出10支菌株,通过培养和降解试验后发现,其中1株革兰氏阴性厌氧菌对MC-LR和MC-RR有着良好的去除效果,3d降解率分别为5.4%和10.2% 。Cousins等的研究表明,MC-LR的ADDA侧链的共轭双键是生物降解的攻击靶位,正是由于这个结构的变化才导致MC-LR毒性的降低或丧失 。