酶标抗体製备技术 _生活百科

酶标抗体製备技术【酶标抗体製备技术】酶标抗体製备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性。用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和β-半乳糖苷酶等。
基本介绍中文名：酶标抗体製备技术
外文名：horseradish peroxidase
缩写：HRP
技术基本要求：酶分子与抗体共价结合
辣根过氧化物酶标抗体製备技术辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部；作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺（DAB）为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在pH3.5～12範围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉澱法分离纯化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色剂。供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为3，3‘二氨基联苯胺(3,3’diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法；反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物；这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种；但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。用HRP标记抗体需藉助交联剂的作用，将酶连线在抗体分子上。常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO) 。改良过碘酸钠法HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff硷。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯（DNFB）封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的结合物。[标记步骤]（1）取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4而二硝基氟苯（DNFB）无水乙醇溶液0.1mL，室温（20℃±）下轻微搅拌作用1h 。（2）加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。（3）加入1mL0.16mol/L乙二醇，室温（20℃±）下轻搅作用1 h，终止氧化反应。（4）加入5mg抗体（Ig），装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液（无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g,蒸馏水加至1 000 mL）1 000 mL中，4℃透析过夜，更换3次。（5）取出透析袋中液体（约3 mL），加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或过夜。（6）加50%饱和硫酸铵（NH4）2SO4溶液（硫酸铵850g，蒸馏水加至1 000 mL，以30%氨水调pH7.2）6 mL沉澱结合物，置4℃30min后，3 000r/min离心30min，取深沉（SPA不需要进行此步）。（7）将沉澱物溶于PBS（0.02M pH7.4）中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。（8）在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或加等量60%甘油，测定工作效价后，小量分装（或冻乾，不需加甘油），低温保存备用。戊二醛交联法戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。反应可在4-40℃温度範围，pH6.0～8.0 的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。[标记步骤]（1）取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温（20℃左右）反应结合18h 。（2）用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析过夜。（3）将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。（4）加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH至9.0～9.6），4℃，电磁搅拌下结合24h 。（5）加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏水），4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。（6）装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装，4℃或-20℃保存。过氧化物酶简介抗过氧化物複合物製备技术Stemberger(1970)等，首先报导了过氧化物酶-抗过氧化物酶複合物（peroxidase-antiperoxidase,PAP）法，此法也称为非标记抗体酶法（unlabelled antibody enzymemethod）。PAP法不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的影响，可大大提高免疫酶法的灵敏度。标记步骤（1）取5mL抗HRP血清，16 000r/min 4℃离心20min，取上清液。（2）加入1mL HRP(2mg/mL)溶液混匀，室温（20℃±）静置1h，16 000r/min，4℃离心20min，取沉澱物。（3）加冷生理盐水反覆洗涤-离心（16 000r/min，4℃离心20min）3次，弃上清，取沉澱物。（4）加入过量HRP溶液4mL（2mg/mL）混匀后，移至小烧杯内。（5）在pH计监控下，边搅拌边加入0.1及0.01mol/L HCl调至pH2.4左右，使沉澱完全溶解。（6）立即加入0.01mol/LnaOH,调pH7.4，16 000r/min，4℃离心20min，取上清液。（7）加入1/10体积的0.075mol/L醋酸钠和0.15mol/L醋酸铵的等量混合液后混匀。（8）电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，并继续搅拌10min，4℃放置20min，16 000r/min，4℃离心20min，去上清，取深沉物。（9）以50%饱和硫酸铵洗涤，4℃、16 000r/min×20min，离心2次，取深沉物。（10）加5mL蒸馏水将深沉物溶解后装入透析袋，用Ph6.75醋酸盐缓冲液（13.5L生理盐水、1.5L蒸馏水、75mL 1.5mol/L醋酸钠及75mL粉酶3moL/L醋酸铵）4℃透析3d，每天换液2次。（11）17 000r/min，4℃离心20min，取上清液进行工作效价鉴定。（12）加等量60%甘油，小量分装，-20℃保存。McAb-PAP製备技术用抗HRP McAb製备PAP複合物的工艺条件较为简便，而且不需严格的条件限制。用小鼠抗HRP McAb製备的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37℃水浴反应2h，即成鼠PAP複合物。以按HRP/IgG克分子比为4︰1製备为宜。硷性磷酸酶标抗体製备技术简介硷性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），系小牛肠黏膜和大肠桿菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。从小牛肠黏膜提取的AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6；从大肠桿菌中提取酶分子量为80kDa，最适pH为8.0 。它的作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐（PNP）、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。AP标记抗体，一般採用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。标记步骤（1）取抗体（2～5mg/mL）1mL，加入AP 5mg溶解。（2）装入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，换液3次。（3）加入2.5%戊二醛20uL，室温（20℃±）放置2h 。4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析过夜，换液3次。（4）移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。（5）取出标记抗体，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。（6）加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量（0.1mL）分装，4℃保存（使用前以pH7.4PBS-吐温溶液将结合物适当稀释）。硷性磷酸酶-抗硷性磷酸酶複合物製备技术Mason等（1978），用硷性磷酸酶代替过氧化物酶，建立了硷性磷酸酶-抗硷性磷酸酶複合物（APAAP）桥联酶标技术。但以AP作为抗原用常规免疫方法製备的抗血清，很难达到APAPP桥联酶标技术的质量要求，在一定程度上限制了此项技术的推广使用。杨志刚等（1989）利用抗AP的McAb建立了一种製备APAAP複合物的简便方法。只需将AP和抗AP的McAb以适当比例混合，4℃结合过夜即可使用。採用改良的ELISA方法检测APAAP複合中AP的最适含量。具体方法是：用羊抗鼠Ig包被微量滴定板；加入一定量的抗APMcAb；分别加入不同量的AP作用后经过洗涤；加底物显色，测定光密度值（OD）。在一定範围内，APAAP複合物溶液中AP含量增加的同时，相应的OD值也随之增大；当AP增加到一定量时（约6～8mg/mL）、OD值保持稳定。