细胞株构建流程细胞株构建 _细胞系

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质粒载体在细胞系构建中需要哪些要素？
在细胞系的构建中，质粒载体需要四个元件。它们是:
启动子，终止子，复制起点，标记基因。
它们执行不同的功能，是不可或缺的。
【细胞株构建流程细胞株构建】如何构建稳定的细胞系？
构建* * *:质粒整合到染色体后，通过相应质粒DNA中的抗性标记筛选细胞系，获得稳定表达的细胞系。
细胞株是通过单细胞分离、培养或筛选，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞系的特殊性质或标记必须在整个培养期间一直存在。原代培养之一次成功传代后为细胞系，由原代培养的原始细胞谱系组成。如果不能继续传代或传代次数有限，可称为有限细胞系，如果能继续培养，可称为连续细胞系，可培养50代以上，无限期培养。
细胞系是通过选择或克隆从原代培养物或细胞系获得的具有特殊性质或标记的培养细胞。从栽培代数来说，可以栽培40-50代。细胞系的特殊性质或标记必须在整个培养期间一直存在。对于人肿瘤细胞，体外培养半年以上，生长稳定，连续传代的可称为连续株或系。
扩展数据:
一般过程
1.筛选浓度的确定:以10-14天细胞全部死亡的抗生素浓度作为筛选浓度；
2.细胞接种:转染实验前一天接种细胞，各种细胞的平板密度取决于各种细胞的生长速度和细胞形态。转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖率；
3.细胞转染(病毒、脂质体、电穿孔、fuge ne 6)；；
4.通过质粒中包含的抗性选择进行筛选；
5.确定筛查结果。
百度百科-细胞株
百度百科-稳定细胞系
如何构建耐药细胞系？
肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是肿瘤治疗失败的重要因素之一，目前已成为肿瘤治疗的绊脚石。因此，探索肿瘤细胞耐药的原因以及如何提高肿瘤细胞对化疗药物的耐药性仍然是研究的热点和难点
肿瘤细胞耐药性的产生是一个复杂的过程，其机制涉及药物代谢、病理学、生理学等多学科，这就决定了肿瘤细胞耐药性的机制是复杂的。因此，体外研究肿瘤细胞的耐药机制仍然具有重要意义。
一种药物长时间作用于某一类细胞，杀死没有耐药性的细胞，而对这类细胞有耐药性的细胞不能被杀死，也就是进行了选择。大量耐药细胞繁殖产生许多耐药后代，但这种药物再次使用时药效大大降低的现象，就是细胞的耐药性。通过体外低浓度梯度递增结合大剂量间歇性冲击* * *，诱导肿瘤细胞对特定药物产生耐药性，从而构建对特定药物具有耐药性的肿瘤细胞系。

文章插图
长期接触低剂量药物引起细胞的药物化学过程发生变化，细胞膜上出现Pgp糖蛋白，使细胞对药物逐渐耐受。随着药物浓度的增加，它们的耐受性逐渐加强。
耐药细胞系的构建
A.检测亲代细胞株的IC50
IC50(半更大抑制浓度)，即半抑制浓度，是指一种物质对某些生物程序抑制50%时的浓度。在细胞增殖方面，可以理解为细胞增殖的抑制使用的是达到正常细胞增殖水平的50%时的药物浓度。IC50通常用于测量药物对细胞的毒性或细胞对药物的耐受性。在药物实验中，IC50常用于评价实验中所用药物的浓度。IC50的计算有很多，比如Excel，Graph Pad Pri，SPSS等等。
B.增加药物浓度法/大剂量药物休克法
1)大剂量药物休克法:将对数生长期(汇合60%-80%)的肿瘤细胞在含有药物浓度的培养液中培养，弃去培养液，用PBS洗涤两次，更换无药物培养基。常规培养和细胞培养一段时间后，重复上述操作，将筛选出的细胞在一定药物浓度的培养液中连续培养，使作用时间不断变化。经过1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时和72小时10个周期后，培养细胞约6-8个月，最终细胞可在一定浓度的药物培养液中稳定生长传代，然后在无药培养一个月后检测细胞的生物学特性和耐药指标。

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