文章插图
腺病毒病毒基因组複製通常在感染后数小时开始，同时早期基因的转录和翻译被关闭，晚期基因开始表达 。大部分的晚期基因的转录是以一个共同的主要晚期启动子（MLP, Major Late Promoter）调控的 。实际上，MLP的活性与病毒基因组複製密切相关，有研究表明一旦腺病毒基因组开始複製MLP的活性将明显增强，对此我们将另外行文详述 。晚期基因主要编码腺病毒的结构蛋白 。病毒结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳，病毒的基因组被包装进去，形成有感染能力的病毒颗粒，并最终裂解宿主细胞被释放出去，完成腺病毒的生活周期 。腺病毒有明显的种属特异性，人的野生型5型腺病毒（wtAd5）感染其他的非人类细胞（如鼠类细胞）后可以表达早期基因，基因组也可有一定程度的複製并能够形成一些不成熟的病毒颗粒，却不能形成成熟的病毒颗粒，也不能二次感染其他细胞 。鉴定方法形态学检查对难于培养的肠道腺病毒，从粪便标本中粗提后，经电子显微镜或免疫电镜观察 。病毒分离与鉴定1．分离培养 标本应儘早从感染部位採集 。採集患者咽喉、眼分泌物，粪便和尿液等，加抗生素处理过夜，离心取上清接种敏感细胞（293、Hep-2或HeLa细胞等），37℃孵育后可观察到典型CPE，即细胞变圆、团聚、有拉丝现象，最突出的表现是许多病变细胞聚在一起呈葡萄串状 。2．病毒鉴定 用萤光标记的抗六邻体抗体与分离培养细胞作用来鉴定腺病毒，也可用血凝抑制（hemoagglutination inhibition，HI）试验或中和试验（neutralization test，NT）检测属和组特异性抗原并鉴定病毒的血清型 。腺病毒可用Shell vial技术进行快速鉴定 。病毒标本经抗生素和离心处理，取上清接种于有细胞的Shell vial培养瓶，孵育1～2天，用特异性六邻体单克隆抗体对其抗原表位进行检测 。也可用病人鼻黏膜上皮脱落细胞直接染色检测病毒抗原 。用DNA杂交或内切酶酶切等鉴定分离培养的病毒DNA；PCR可用于腺病毒感染的诊断，引物设计主要根据腺病毒六邻体、VAI和VAII编码区序列，能检测所有血清型，而且其敏感性很高，能检测某些病人潜在的腺病毒 。用腺病毒41型BgIII-D片段作探针诊断腺病毒腹泻，其检出率可达80% 。血清学检查常用血清学方法包括IF、CF、EIA、HI及NT等试验，採取患者急性期和恢复期双份血清进行检测，若恢复期血清抗体效价比急性期增长4倍或以上，即有诊断意义 。快速检测血清可用ELISA法或乳胶凝集试验 。抗原检测常用来直接检测腺病毒在呼吸道和胃肠道的感染,较快速且灵敏度较高 。免疫萤光(尤其对呼吸道标本、咽拭子和活组织标本)和酶免疫分析(尤其对于粪便标本)是常用的方法,与细胞培养相比,免疫萤光所测腺病毒的灵敏性能提高40%~60%,其它直接测定抗原的方法包括免疫层析法和乳胶凝集法 。研究证实,与细胞培养检测方法相比,使免疫层析试剂盒所测定的灵敏度可达90% 。防治原则腺病毒的甲醛灭活疫苗已被用于某些人群的预防，而且将来有被用人二倍体细胞培养的减毒活疫苗所替代的可能 。但因腺病毒对动物具有致癌作用，人们对全病毒疫苗的作用与安全性存有疑虑 。此外加强游泳池和浴池水的消毒，可使水传播性结膜炎爆发的危险性降至最小，在作眼的检查时应严格无菌操作，对所用设备充分灭菌，也可控制流行性结膜炎的发生 。对腺病毒感染的治疗仍无有效药物 。基因研究腺病毒基因产物的主要功能E1区基因表达产物可以进一步分为E1A和E1B 。E1A主要由两种成分构成，分别为289R（或13S）和243R（或12S） 。这些E1A蛋白的主要功能是调节细胞代谢，使细胞对病毒複製更易感E1B19K与细胞Bcl-2基因的表达产物同源，可以通过灭活和清除Bax家族成员来防止细胞发生凋亡或坏死 。E1B55K基因产物可以下调p53基因的转录水平，当然这种调节功能不是绝对的，其他一些腺病毒基因（如E4 orf6）也参与了这一过程 。另外，E1B55K基因产物还与病毒複製、病毒晚期mRNA的转录以及病毒RNA的转运有关 。E2区基因表达产物可分为E2A和E2B 。其中，E2A即DNA结合蛋白（DBP，DNA Binding Protein）；E2B主要产物有两种，分别是末端蛋白前体（pTP）和病毒DNA聚合酶（pol） 。三种蛋白与至少三种细胞内的因子相互作用，启动腺病毒DNA複製以及病毒晚期基因的转录和翻译过程 。E3区基因表达产物主要功能是破坏宿主的免疫防御机制，而与病毒基因组的複製无关 。E3基因的产物之一11.6Kd，由于可以在病毒感染的晚期裂解细胞并释放病毒颗粒而被称为腺病毒死亡蛋白（ADP，adenovirus death protein） 。gp 19K蛋白可以在内质网上与MHC I类分子的重链结合阻止其转运到细胞表面，并且可以延缓MHC I的表达 。RID α&β以及14.7Kd可以抑制由TNF诱发的细胞凋亡，促进Fas降解，下调TNF受体水平 。E4区基因表达产物E4区的基因产物通常被称为orf 1~6/7，主要与病毒信使RNA的代谢有关 。还有促进病毒DNA複製以及关闭宿主蛋白合成的功能 。研究发现，一些E4产物可以与DNA激活的蛋白激酶结合，防止病毒DNA发生串联 。由于该激酶可以激活p53基因，因此可以认为一些E4区基因产物可以抑制细胞凋亡 。许多E1B和E4基因产物都与拮抗E1A蛋白功能有关 。比如，E4 orf4抑制E1A对E2F启动子的激活；E4 orf3VA RNA使一些由腺病毒转录的非翻译RNA，与腺病毒抵抗宿主细胞免疫有关 。传播特点宿主範围广对人致病性低腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达 。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白 。特别需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮细胞性，而人类的大多数的肿瘤就是上皮细胞来源的 。另外，腺病毒的複製基因和致病基因均已相当清楚，在人群中早已流行（70-80%成人体内都有腺病毒的中和抗体存在） 。人类感染野生型腺病毒后仅产生轻微的自限性症状，且病毒唑治疗有效 。在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态 。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞 。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比 。能有效进行增殖 滴度高腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗 。与人类基因同源腺病毒载体系统一般套用人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行準确的翻译后加工和适当的摺叠提供了一个理想的环境 。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能 。不整合到染色体中 无插入致突变性逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因 。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因 。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特徵的转基因动物的一个较好的系统 。能在悬浮培养液中扩增293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增 。大量事实证明悬浮293细胞可在1～20L的生物反应器中表达重组蛋白 。能同时表达多个基因这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统 。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白 。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况 。正是由于具有以上一些优点，腺病毒被极其广泛地套用于体外基因转导、体内接种疫苗、和基因治疗等各个领域 。防治方法腺病毒感染主要在冬春季流行，容易在幼稚园、学校和军营新兵中暴发流行 。一般来说，腺病毒主要通过呼吸道飞沫、眼分泌物，经呼吸道或接触传播；肠道感染主要通过消化道传播 。其预防措施和其他呼吸道、消化道传染病预防相似，主要是勤洗手，勤消毒，避免接触患者及其呼吸道飞沫 。平常多饮水，多吃蔬菜和水果，注意锻鍊身体；室内多通风，保持室内环境清洁；冬春流行季节儘量少去人员密集的公共场所，外出时戴口罩，避免接触病人，以防感染 。一旦发生急性发热、咽喉疼痛和结膜炎的症状，要及早到医院看病，早隔离、早治疗 。出现5人以上集体发病的情况要及时向所在地区防疫部门报告，及时採取有效的防控措施，避免疾病漫延 。在腺病毒流行季节，托幼机构上呼吸道感染患儿应回家隔离休息，以免造成传播流行 。患病后儘量在附近医院就诊，避免到病人较集中的大医院观察室输液，以防造成交叉感染 。出现严重咳嗽和呼吸困难症状多属严重病例，应及时到医院住院治疗，以免延误病情 。