光学显微镜製片技术【光学显微镜製片技术】生物材料製成适于在光学显微镜下观察的薄片的技术 。新鲜的生物材料虽然用简单的方法做成临时製片也可观察 ， 但为了保存以备以后的观察 ， 常需按一定步骤製成永久製片 。显微製片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4大类
基本介绍中文名：光学显微镜製片技术
适用：新鲜的生物材料
方法：切片法整体封片法涂片法压片法
参考书籍：《组织切片技术》
简介将生物材料製成适于在光学显微镜下观察的薄片的技术 。新鲜的生物材料虽然用简单的方法做成临时製片也可观察 ， 但为了保存以备以后的观察 ， 常需按一定步骤製成永久製片 。显微製片首先要儘量保持生物材料的天然状态 ， 避免膺像、变形和失真,因此须将生物材料做固定处理;製片必须薄而透明 ， 才能在光学显微镜下成像 ， 除将材料切成薄片或通过轻压或其他手段使之分散外 ， 还需採用其他方法使它透明和染色 ， 以便更好地观察到结构的细节 。需长期保存的製片 ， 还应进行脱水和封固 。显微製片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4大类 。切片法光学显微镜的切片厚度在 2～25微米之间 ， 一般动植物材料的切片以厚10微米左右为合适 。切片法根据包埋剂的不同而有所不同 。最常用的是石蜡切片法 ， 它适用于一般生物材料 。棉胶切片法 ， 把生物材料经棉胶包埋后切片 。适用于特别坚硬的材料或特别柔软而体积大的材料（如完整的大脑） 。冰冻切片法 ， 将生物材料在一定的介质中冰冻固化后切片 。适用于研究活体标本或作组织化学的研究 。乙二醇甲基丙烯酸脂法（简称GMA法）,适用于製作1～3微米厚的切片 。石蜡切片法包括固定、包埋、切片、染色、脱水和封固等步骤 。关键是把生物材料用石蜡包埋 ， 以石蜡为支持物 ， 把浸在蜡块中的生物材料切成理想的薄片 。操作过程为：固定→水洗→从低浓度逐级到高浓度酒精脱水→二甲苯透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→二甲苯脱蜡→逐级从高浓度到低浓度酒精处理 ， 最后过渡到水→染色→逐级从低浓度到高浓度酒精脱水→二甲苯透明→树脂胶封固 。其中的基本步骤在各种製片技术中都是相同的 。固定用物理的或化学的方法将生物材料迅速杀死、使蛋白质变性和凝固 ， 达到保持细胞的形状和内部结构的目的 。物理固定法常用冷冻处理或火焰烘烤 。化学固定法 ， 主要是把生物材料迅速浸泡在固定剂中 。固定剂常是含有几种化合物的混合液 ， 既有强烈凝固蛋白质的化合物 ， 也有非凝固性的化合物 ， 它们对蛋白质起交联和稳定作用 ， 即所谓“鞣化作用” 。已有的一些比较理想的固定剂,大多以最初设计者命名（表1） 。脱水和透明固定之后 ， 一般须用水沖洗材料移去多余的固定液 。为了使材料能为石蜡所浸透 ， 必须将水移去 ， 换成能溶解石蜡的有机溶剂 ， 如二甲苯等 。在製片中常用的脱水剂是乙醇（酒精） ， 将浸在水中的材料依次移入从低浓度到高浓度的乙醇中 ， 最后移到纯乙醇中完成脱水 。然后将脱水后的材料移入二甲苯中 。浸透和包埋在温箱中用溶化的石蜡取代二甲苯 。使材料逐步为纯石蜡所浸透 ， 然后将材料连同熔化的石蜡 ， 倒入小纸盒中 ， 在室温下或在冷水中使包埋有材料的蜡块迅速凝固 。浸透和包埋的目的是使材料藉石蜡的支持能被切成薄片 。切片将包埋好的材料用切片机切成薄片 。切片机有轮转式切片机（图1）和滑行式切片机（图2）两种 。切片机一般用专门的钢刀 。包埋材料的蜡块边缘要整齐 ， 使被切下的蜡片前后能自然地连线 ， 形成蜡带 ， 有利于製备连续切片 。切片后 ， 将蜡带或单个蜡片贴在载玻片上 。染色先将已贴上有蜡片或蜡带的载玻片 ， 在染色缸中经二甲苯脱蜡 ， 再经过一系列从高浓度到低浓度的酒精而过渡到水中 ， 即可染色 。生物染料种类繁多 ， 用途各异 ， 可区分为硷性染料和酸性染料两大类 。硷性染料为一种色硷盐 ， 可染细胞核 ， 如苏木精、甲基绿和番红等 。酸性染料为一种色酸盐 ， 可染细胞质或核以外的其他成分,如伊红、橘红G和固绿等 。硷性染料和酸性染料混合后称中性染料 ， 也称複合染料 ， 如芮氏染色剂和姬姆萨染色剂等 。染色可只用一种染料 ， 但通常採用复染 ， 例如：先染硷性染料显示核 ， 再染酸性染料显示其他结构 。染色的深浅 ， 随材料的不同和浸染时间的长短而不同 ， 因此要达到合适的程度常需要进行分色 ， 即先过度染色,再使其褪色,当达到合适的程度后即中止 。显微製片中採用何种染色方法 ， 需根据材料和目的来选择（表2） 。上述染色方法都是用于经固定而被杀死的材料 ， 在研究生活状态的生物材料或鉴定细胞的活性时 ， 则用活体染色法 。活体染色需用无毒性的活体染料 ， 并能使特异的细胞结构着色 。例如：中性红可以显示活细胞的液泡而詹纳斯绿可以显示线粒体等 。封固染色之后一般都要用封固剂和盖玻片把材料封固起来 。只有像血液、细菌等需用油浸镜观察的製片才可不加盖玻片 。封固剂应有较高的折射率和固化后不易碎裂的特点 ， 常用的封固剂是加拿大树脂 。整体封片法用于单细胞、微小生物体或分散的器官的整装製片方法 。此法也需要经过固定、染色、脱水、透明和封固各个步聚 。材料常用洋红 。代氏苏木精等单一染色法 ， 但也可复染 。整体封片法中常用冬青油、丁香油一类香精油作为透明剂 ， 以代替二甲苯 ， 这样可避免标本脆裂 ， 较厚的标本在封固时 ， 要在盖玻片下垫以适当大小的碎玻璃或玻璃丝以免压坏 。涂片法把易于分散的生物标本涂布在载玻片上的製片方法 。此法的永久製片需经固定、染色 ， 脱水等步聚 ， 适用于细菌、血液、花粉母细胞和精子等细小而分散的材料 。血液涂片便是一例 。压片法将天然的、易于分散的组织或经过处理后易于分散的组织 ， 如动物的精母细胞、果蝇的唾液腺、植物的花粉母细胞和根尖细胞等放在载玻片上、再加盖玻片 ， 用力压碎组织 ， 使细胞或细胞内的结构铺展成一层的製片方法 。压片法常用于观察染色体 ， 通常用醋酸洋红、地衣红和石炭酸复红染色 。参考书目芮菊生等：《组织切片技术》 ， 人民教育出版社 ， 上海 ， 1980 。李正理：《植物製片技术》,科学出版社,北京 ， 1982 。朱澂：《植物染色体及染色体技术》,科学出版社,北京 ， 1982 。