文章插图
犬恶丝虫病基本介绍中文名：犬恶丝虫病
英文名：Heartworm disease
病原体犬恶丝虫病又名：心丝虫病 ,形态：雄 10 16cm；雌 25 30cm 形态： 10—16cm 16cm； 25—30cm 白色 、细长 。白色、细长 。宿主：犬、猫、狐、狼，寄生部位：右心室、肺动脉。流行病学症状心内膜炎，右心肥大心内膜炎 。循环障碍，以肝、肺为显 。循环障碍，以肝、肺为显 。早期、少量寄生不明显 。早期、少量寄生不明显 。循环障碍引起呼吸困难、贫血、心悸、 循环障碍、引起呼吸困难、贫血、心悸、 心杂音、腹围增大（腹水） 。心杂音、腹围增大（腹水） 。结节性皮肤病 。诊断将犬恶丝虫成虫粗製抗原经过凝胶柱层析后进行间接ＥｌＩＳＡ试验，确定最佳实验条件，建立犬恶丝虫病的同种纯化抗原ＥＬＩＳＡ诊断法 。通过阻断性试验、交 叉反应试验、敏感性和特异性试验、重複性试验及与病原学方法比较，评价其效果 。结果 纯化抗原ＥＬＩＳＡ方法与 结论 成功建立犬恶 犬钩虫和蛔虫感染犬血清无交叉反应，检出的阳性血清最高抗体滴度为１：２５ ６００，重複性好 。丝虫病ＥＩ 。ＩＳＡ诊断方法，可替代虫检法对犬恶丝虫病进行早期诊断 。犬恶丝虫病是由犬恶丝虫成虫寄生于犬的右心室及肺动脉（少数见于胸腔、支气管）引起循环障碍、呼吸困难、贫血、猝死等症状的一种丝虫病 。该病不仅感染 犬，几乎所有在发生心丝虫病区域中未被保护的动物 （猫及其他野生肉食动物等）都有可能被感染，甚至危 害人类健康 。犬恶丝虫病主要通过血检微丝蚴确诊，该法容易 出现假阴性 。酶联免疫吸附试验（ＥＩ 。ＩＳＡ）是一种特异 性强、敏感性高的血清学方法 。用牛指状丝虫检测犬丝虫抗体的ＰＰＡ—ＥＬＩＳＡ法和用 牛腹腔丝虫Ｇ抗原的ＥＬＩＳＡ法诊断犬的丝虫病 。从 理论上讲套用同种抗原ＥＩ 。ＩＳＡ检测的血清抗体滴度 最高 。因此，本实验採用犬恶丝虫成虫纯化抗 原，建立了诊断犬恶丝虫病的ＥＬＩＳＡ法，结果报导如 下 。ｍｉｎ，取上清，备用 。参考阳性血清 犬血液５ ｍ１，３ ０００ 採集丹东地区的犬恶丝虫感染 ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取血清，备用 。ｒ／ｍｉｎ离 １．３钩虫感染犬血清无菌采虫检微丝蚴阴性、粪检 其他线虫阴性、钩虫阳性犬血液５ 心５ ｍｉｎ，取血清，备用 。１．４ ｍｌ，３ ０００ 蛔虫感染犬血清 无菌采虫检微丝蚴阴性、粪 ｍｌ，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ 检其他线虫阴性、蛔虫阳性犬血液５ 离心５ ｍｉｎ，取血清，备用 。２抗原的製备 将犬恶丝虫成虫用生理盐水洗净、剪碎，加入冷 ｐＨ ７．４磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）研磨，液氮反覆冻融６～８ ０００ 次，超音波粉碎，１０ ｒ／ｍｉｎ离心３０ ｍｉｎ，取上清液，Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白含量为０．２２５ ｍｇ／ｍｌ 。将适当浓 材料和方法 １ 血清 参考阴性血清 採集长春市刚出生的德国牧羊 ｒｎｌ，３ ０００。犬（其母犬虫检阴性）血液５ ｒ／ｍｉｎ离心５万方的上清液装Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ一２００凝胶柱，用０．０１ ｍｏｌ／Ｉ 。ｐＨ ７．４ 的阳性滴度评价纯化抗原的敏感性 。现场对比试验 在市郊两个犬恶丝虫病流行犬 场，分别用虫体浓集虫检法和ＥＩ 。ＩＳＡ法检测犬恶丝虫 感染率，比较两种检测法的阳性率 。结 果 ＰＢＳ洗脱，分别收集各峰洗脱液 。共出现２个 洗脱峰，紫外分光光度法测定蛋白含量分别为１峰 ０．０２５ ｍｇ／ｍｌ，２峰为０．０３ ｍｇ／ｍｌ 。分装，一２０℃保 存 。ＩＳＡ方法操作 。酶联葡萄糖球菌Ａ蛋 白（ＨＲＰ—ＳＰＡ）为上海生物製品研究所生产，底物为过 氧化氢一邻苯二胺 。用酶联免疫检测仪测定各孔的Ａ值 。计算被检 血清Ａ值Ｓ与阴性对照血清Ａ值Ｎ的比值 。以１５ 份阴性参考血清作１：１５０稀释后的ＥＬＩＳＡ Ａ值×２ 为阳性界值判定试验结果 。每次每板均设参照阴、阳 性血清和空白对照，以空白调零 。诊断抗原的最佳工作浓度 层析１峰抗原ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｎ值＞２．００且肉眼观察 阴性孔与阳性孑Ｌ颜色差异明显的最佳稀释度为１：６４ 。层析２峰的抗原性较弱，ＥＩ 。ＩＳＡ试验的Ｓ／Ｎ值较小 。２血清最佳稀释度 Ｓ／Ｎ值＞２．００，且肉眼观察阳性孔与阴性孔差异 明显的血清最佳稀释度为１：１６０ 。本试验中，血清按 １：１５０稀释 。试验的临界值 酶标ＳＰＡ选取 纯化抗原１ １５份参考阴性血清平均Ａ值为０．０３１，因此确定 ０．０６为ＥＩ 。ＩＳＡ的临界值 。４试验的特异性和敏感性 检测参考阳性血清３６份，检出阳性３３份，符合率 为９１．７％，阳性血清最高滴度为１：２５ ６００ 。检测参 考阴性血清１５份，无１份阳性，阴性符合率为１００％ 。用１：６４稀释的层 ５６０ 最佳试验条件的确定 酶标ＳＰＡ工作浓度的选定 ３．１．１ 推荐浓度，按ｌ：４０倍稀释 。３．１．２纯化抗原最佳工作浓度的测定 1峰、２峰均作倍比稀释，阳性和阴性血清分均作１：１００ 稀释，酶标ＳＰＡ １：４０稀释，进行ＥＩ 。ＩＳＡ试验，优选 最佳抗原稀释度 。３．１．３血清最佳稀释度的测定 析抗原１峰包被，血清作１：２０、１：４０……、１：２ 佳抗体稀释度 。３．２ ５试验的交叉反应 检测钩虫感染犬血清和蛔虫感染犬血清各５份，结果均为阴性 。６试验的重複性 １０份参考阴性血清重複检测２次，平均Ａ值分别 为０．０１２和０．０１６，差异无显着性（ｔ—Ｏ．５１８４，Ｐ＞０．０５）；１０份阳性血清２次检测的平均Ａ值分别 为ｏ．２３４和Ｏ．２３７，差异亦无显着性（ｔ一２．０９４，Ｐ＞Ｏ．０５） 。稀释，酶标ＳＰＡｌ：４０稀释，进行ＥＬＩＳＡ反应，优选最 阻断性试验 将层析１峰抗原作１：８、１：１６ ……１：４ ０９６稀释 。将５份参考阳性血清等量混合后 取１００“１分别与以上抗原作１：１混合，３７℃孵育３ 在相同条件下进行ＥＬＩＳＡ试验，分别测定其Ａ值 。３．３ ｈ 后再各取１００ ｔＡ与相应稀释度的等量层析１峰抗原 符合率试验 选取层析１峰抗原、血清、酶标 ７阻断试验结果 抗原层析１峰经系列稀释后作阻断试验，１：８、 １：１６稀释度的ＥＬＩＳＡ Ａ值比阻断前降低５０％以上 。８ ＳＰＡ的最佳工作浓度或稀释浓度检测参考阴性１５ 份、参考阳性血清３６份，分别测定其Ａ值，根据临界 值判定试验结果，计算阴性及阳性符合率 。３．４交叉反应试验选取层析１峰抗原、血清、酶标 ＳＰＡ的最佳工作浓度或稀释浓度检测蛔虫、钩虫感染 犬血清各５份，根据临界值判定结果，计算交叉阳性 率 。３．５重複性试验取纯化抗原、血清、酶标ＳＰＡ的最 佳工作浓度或稀释浓度，在相同条件下分别检测１０份 参考阳性血清和１０份阴性血清各２次，分别计算每次 试验的参考阳性血清和参考阴性血清Ａ值均数，并作 显着性检验 。３．６敏感性试验 纯化抗原、酶标ＳＰＡ选用最佳工 作浓度 。随机将５份参考阳性血清混合，作１：２００、 １：４００……１：１０２ ４００稀释后作ＥＬＩＳＡ 。根据血清 ＥＬＩＳＡ与虫检法比较 用ＥＩ 。ＩＳＡ法检测６２只犬血清抗体，阳性３２只，阳性率为５１．６％；用浓集法查犬恶丝虫微丝蚴，１８只 阳性，阳性率为２９．０％，差异有显着性（ｔ一２．５５０，Ｐ＜Ｏ．０５） 。讨 论 本试验採用同种纯化抗原检测犬恶丝虫抗体，提 高了ＥＬＩＳＡ方法的特异性和敏感性，检测犬恶丝虫感 染犬血清的最高抗体滴度达１：２５ ６００，高于资料报导 的用异种丝虫纯化抗原检测犬恶丝虫阳性血清的最高 抗体滴度为１：６ ４００的结果，且不与钩虫和蛔虫感染 犬血清发生交叉反应 。治疗驱杀成虫：套用硫乙胂铵钠2.2/kg体重静脉注射，一日2次，连用两天 。缓慢注入，药液不可坏死 。该药是一种肝毒和肾毒物，因此用药前肝、肾功能必须正常 。中毒表现为持续性呕吐，黄痘和橙色尿，此时应停止疗程，可套用二硫基丙醇解毒 。驱杀微丝蚴：驱杀成虫和微丝蚴之间相隔6周时间 。可套用左旋咪唑，剂量10mg/kg体重口服，连用15天；治疗6天检查血液，当血液中检查不出微丝蚴时，停止治疗 。也可用伊维菌素0.005-01mg/kg体重一次皮下注射 。预防