医学术语基因治疗( 三 ) _生活百科

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基因治疗(二)基因载体的选择(三)靶细胞的选择(四)基因转移方法(五)转导细胞的选择鉴定(六)回输体内基本步骤转移在基因治疗中迄今所套用的目的基因转移方法可分为两大类：病毒方法和非病毒方法。基因转移的病毒方法中，RNA和DNA病毒都可用为基因转移的载体。常用的有反转录病毒载体和腺病毒载体。转移的基本过程是将目的基因重组到病毒基因组中，然后把重组病毒感染宿主细胞，以使目的基因能整合到宿主基因组内。非病毒方法有磷酸钙沉澱法、脂质体转染法、显微注射法等。

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基因治疗表达目的基因的表达是基因治疗的关键之一。为此，可运用连锁基因扩增等方法适当提高外源基因在细胞中的拷贝数。在重组病毒上连线启动子或增强子等基因表达的控制信号，使整合在宿主基因组中的新基因高效表达，产生所需的某种蛋白质。安全措施为避免基因治疗的风险，在套用于临床之前，必须保证转移-表达系统绝对安全，使新基因在宿主细胞表达后不危害细胞和人体自身，不引起癌基因的激活和抗癌基因的失活等，尤其是在将反转录载体用于基因转移时，必须在套用到人体前预先在人骨髓细胞、小鼠体内和灵长类动物体内进行类似的研究，以确保治疗的安全性。现状前景肿瘤的基因治疗爱滋病的基因治疗遗传病的基因治疗基因治疗研究一般要符合下列要求①为已明确了的单基因缺陷疾病；②仅限于体细胞；③靶细胞的亲缘性和可操作性等；④有明显疗效和无或低危害性等；⑤表达水平稳定时程长；⑥必须有动物实验基础。人类细胞基因治疗的临床实验已经开始。进行基因治疗必须具备下列条件：①选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚；②纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件；③该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；④具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。已对若干人类单基因遗传病和肿瘤开展了临床的基因治疗。1．複合免疫缺陷综合徵的基因治疗1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（ADA）导入一个4岁患有严重複合免疫缺陷综合徵（SCID）的女孩。採用的是反转录病毒介导的间接法，即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞，并用白细胞介素Ⅱ（IL－2）刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入患儿。大约1－2月治疗一次，8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25%，未见明显副作用。此后又进行第2例治疗获得类似的效果。2．黑色素瘤的基因治疗对肿瘤进行基因治疗是人们早已期望的事，在进行了多方面探索的基础上，发现了肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte-TIL，即能在肿瘤部位持续存在而无副作用的一种淋巴细胞）在肿瘤治疗中的作用。于1992年实施了TNF/肿瘤细胞和IL－2/肿瘤细胞方案，即分别将IL－2基因肿瘤坏死因子（tumor necrosis ractor，TNF）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部，3周后切除注射部位与其引流的淋巴结，在适合条件下培养T细胞，将扩增的T细胞与IL－2合併用于病人，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90%的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。由于携有TNF的TIL可积于肿瘤处，因而TIL的套用提高了对肿瘤的杀伤作用。3．其它遗传病的基因治疗其它遗传病诸如白种人中常见的囊性纤维化的进展很快。对于DMD的基因治疗，由于有小鼠动物模型，也取得一定进展。例如1993年法国将Ad-RSVmDys（腺病毒－罗斯病毒小肌营养不良蛋白基因重组体）注入小鼠肌内成功。即用腺病毒为载体，与小肌营养不良蛋白（minidystrophin）基因的cDNA重组，在RSV启动子启动下，作肌肉注射，证明可在mdy小鼠肌肉表达，此外，对一些遗传病如血友病，地中海贫血、高雪氏病等正在探索中。浙江大学孔德华博士等单位对乙型血友病的基因治疗也进行了有意义的探索，他们在兔模型的基础上，将人第Ⅸ因子基因通过重组质粒（pcmvix）或重组反转录病毒（N2CMVIX）导入自体皮肤成纤维细胞，获得可喜的阶段性成果，相信不久的将来，基因治疗会在我国取得成功。4．反义技术又称反义寡核苷酸（antisenseoligodeoxynucleotides）技术，是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或複製，控制细胞生长在中间阶段,使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的、用反义DNA已对某些癌症进行临床试验。这类反义技术只能认为是一种从基因水平进行治疗的技术，它们以不同方式，在DNA複製、转录和翻译水平发挥作用。由于它们的分子量低，故而有潜力进入靶细胞，但其临床稳定性、毒性、细胞通透性等各方面都需要进一步研究。5．药物靶向治疗（drugstargeting）此法机理可概括为病毒导向酶的药物前体治疗（virus directed enzyemeprodrug therapy，VDEPT），即用反转录病毒载体的外源基因转移到细胞内。该基因编码一种酶，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒素複合物。带有这一基因的病毒载体只在特殊组织或肿瘤细胞中而不在正常细胞中表达。例如，胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase）可将无害的5－氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）转变为细胞毒素5－氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）。此病毒可感染正常细胞和癌细胞，但将该酶基因连线到一种“分子开关”后，则只能在肿瘤细胞中表达。Sikora等设计一个“嵌合小基因（chimeric minigene）”，即将酶基因连线到erbB2基因启动子的下游，此启动子活性增强，使erbB2在乳腺癌细胞中过度表达。此时，药物5－FC注入细胞后即转变为5－FU而致癌细胞死亡。而当5－FC给予含有此嵌合基因却无erbB2表达的细胞时，亦无药物前体活性。这一基因治疗的新策略，可有可能使人对肿瘤等不同疾病进行基因治疗。已批准治疗的病例约120例，其中约110例为肿瘤，遗憾的是，除黑色素瘤有些苗头外，全都未能成功。治疗了10余例单基因病，除ADA缺乏症和乙型血友病有一定疗效外，其余都还在实验阶段。但人们再也不怀疑基因治疗不仅可能办到，而且指日可待。在中国1991年,我国科学家进行了世界上首例血友病B的基因治疗临床试验,目已有4名血友病患者接受了基因治疗,治疗后体内IX因子浓度上升,出血症状减轻,取得了安全有效的治疗效果。随后,我国科学家利用胸腺激酶基因治疗恶性脑胶质瘤基因治疗方案获準进入1期临床试验,初步的观察表明,生存期超过1年以上者占55%,其中 1例已超过三年半,至今仍未见肿瘤复发。此外,採用血管内皮生长因子基因治疗外周梗塞性下肢血管病基因治疗方案也已获準进入临床试验。我国已有6个基因治疗方案进入或即将进入临床试验。总的来看,我国基因治疗产业比美国落后了约4年,正处于成长阶段,绝大部分还处于实验室研究阶段,仅有大约5个项目通过审批进入特批临床试验或I、Ⅱ期临床试验。伦理学1．导入基因的稳定高效表达外源基因转移入病人体内细胞表达，首先与转移方法有关。化学和物理方法所导入的基因效率低，自然表达也差。选择适当的受体细胞，也是为了导入基因能稳定高效的表达。骨髓作为受体细胞使用最多。反转录病毒载体介导基因，只能对分裂状态时的细胞进行传染，因此採取如5－FU处理，使细胞分裂增强，再用含有目的基因病毒颗粒传染可获较好效果。所以，对骨髓细胞培养、干细胞纯化、培养时使用造血因子等方法，可增加基因稳定高效表达。2．导入基因的安全性基因治疗的安全性应确保不因导入外源目的基因而产生新的有害遗传变异，这是因为採用反转录病毒载体而引起的问题。因此，应构建相对安全的反转录病毒载体。至于引起插入突变可能失活一个重要基因，或更严重的激活一个原癌基因，这个问题的危险程度到底有多大仍不清楚，但至今的实践表明尚未见明显严重问题。为安全有效地进行基因治疗，任一方案的实施，都要根据严格的技术规程与标準，由有关的行政管理部门批准实施。与安全性相联繫的就是生殖细胞基因治疗。虽然在人类尚未实施，但在动物实验已获成功，这就是转基因的动物出现。这一事实既给人类生殖细胞基因治疗带来了希望，同时也使人们耽心这种遗传特徵的变化世代相传，将给人类带来的是福还是祸。因此，许多科学家不仅对此持慎重态度，还有的持反对态度，也就是基因治疗可能具有的潜在危险性。3．基因治疗与社会伦理道德体细胞基因治疗是符合伦理道德的，但试图纠正生殖细胞遗传缺陷或通过遗传工程手段来改变正常人的遗传特徵则是引起争议的领域。从历史上看，科学的发明创造对人类生存发展的影响极其深刻，故遗传学发展到今天，可以进行基因治疗，应该说是符合伦理道德的。重要的问题是取得社会的理解配合。首先是病人及其亲属的配合。因此，宣传基因治疗的科学性与安全性以及人类健康的重要性，以提高人们的认识，同时建立并完善医疗法制与措施也是必要的。为安全计，在临床试验之前，必须在动物研究中达到三项基本要求：①外源的基因能导入靶细胞并维持足够长期有效；②该基因要以足够的水平在细胞中表达；③该基因应对细胞无害。基因治疗的历史沿革（1）1962年Szybalski等人类DNA去转化人类细胞，发现Ca2﹢有刺激DNA转入细胞的作用，为人工转移遗传物质迈出第一步。（2）1967年Nirenberg提出遗传工程空用于人类基因治疗。（3）1968年Burnett等用DEAE协同转移的方法将病毒导入培养细胞。（4）1972年Grahant等对磷酸钙介导的DNA转移过程进行了详细的研究，使这一技术得到普遍的接受和套用。（5）70年代初Graessman和Dicumak奠定了用显微注射法转移基因。（6）1973年美国科学家和几名医生在德国进行了首次基因治疗实验。病人是一对体内缺乏一种稀有酶的姐妹研究人员将一种携带有可使病人本身的酶分泌恢复正常的的病毒-肖普化乳头瘤病毒注入患者体内。实验无疗效也无副作用。（7）1980年美国医生对两名严重地中海贫血患者进行基因治疗，但也未能获得成功。（8）1988年美国国家卫生研究院重组DNA谘询委员会首次批准将标记基因导入肿瘤浸润淋巴细胞的实施方案。其结果对病人无害作用。基因治疗逐渐解禁。（9）1990年9月研究人员把线桿脱氢酶基因转入患者体内，其症状明显缓解，治疗获得成功。（10）在1991年中国复旦大学的研究人员进行了“成纤维残暴基因治疗血友病B”项目，此外还开展了针对肿瘤和血液病的基因治疗。（11）2000年9月，一名18岁的男青年因基因治疗而死于美国费城。美国《科学》杂誌曾连续刊登了美国食品和药品管理局（FDA）宣布暂时禁止某大学进行基因治疗试验的报导。（12）截至2005年7月，全世界已获準的基因治疗临床实验方案达1076项，其中，66%是针对癌症的治疗。经过十多年的发展，基因治疗的研究已经取得了不少进展。但是，如今都还处于初期临床试验阶段，还不能保证稳定的疗效和安全性。儘管存在着许多障碍，但基因治疗的发展趋势仍是令人鼓舞的。或许正如基因治疗的奠基者所欲言的那样，基因治疗这一新技术将会推动21世纪的医学革命。

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