医学术语基因治疗( 二 ) _生活百科

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主要分类按基因操作一类为基因修正（gene correction）和基因置换（gene replacement），即将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能；或特异封闭某些基因的翻译或转录，以达到抑制某些异常基因表达。

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基因治疗按靶细胞又可分为生殖细胞（germ-line cell）基因治疗和体细胞（somatic cell）基因治疗。广义的生殖细胞基因治疗以精子，卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。由于当前基因治疗技术还不成熟，以及涉及一系列伦理学问题，生殖细胞基因治疗仍属禁区。在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞。给药途径①ex vivo 途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞（或异种细胞），经体外细胞扩增后，输回人体。ex vivo基因转移途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术複杂、难度大，不容易推广；②in vivo 途径：这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA 。in vivo基因转移途径操作简便，容易推广，但目前尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫排斥及安全性等一系列问题。策略基因矫正纠正致病基因中的异常硷基，而正常部分予以保留。基因置换指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA 完全恢复正常状态。基因增补把正常基因导入体细胞，通过基因的非定点整合使其表达，以补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增强，但致病基因本身并未除去基因失活将特定的反义核酸（反义RNA、反义DNA)和核酶导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。自杀基因在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因” 。免疫治疗免疫基因治疗是把产生抗病毒或肿瘤免疫力的对应与抗原决定簇基因导入机体细胞，以达到治疗目的。如细胞因子(cytokine)基因的导入和表达等。耐药治疗耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。如向骨髓干细胞导入多药抗性基因中的mdr-1 。基因治疗1．基因转移方法（1）特异正常基因的分离与克隆：套用重组DNA和分子克隆技术结合基因定位研究成果，已有不少基因并将会有更多人类基因被分离和克隆，这是基因治疗的前提，在当代分子生物技术条件下，一般来说，只要有基因探针和準确的基因定位，任何基因都可被克隆。除此，如今既可人工合成DNA探针，还可用DNA合成仪在体外人工合成基因，这些都是在基因治疗前，分离克隆特异基因的有利条件。（2）外源基因的转移：基因转移（gene transfer）是将外源基因导入细胞内，其转移方法较多，常用的要有下列几类：1）化学法：将正常基因DNA（及其拷贝）与带电荷物质和磷酸钙、DEAE－葡萄糖或与若干脂类混合，形成沉澱的DNA微细颗粒，直接倾入培养基中与细胞接触，由于钙离子有促进DNA透过细胞有作用，某些化合物可扰乱细胞膜，故可将DNA输入细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，在适当的条件下，整合基因得以表达，细胞亦可传代。这种方法简单，但效率极低，一般1000－100000个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。要达到治疗目的，就需要从病人获得大量所需的受体细胞。当然，可以通过选择培养的方法来提高转化率。2）物理法：包括电穿孔法和直接显微注射法。①电穿孔法：电穿孔法（electroporotion）是将细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，周围基质中的DNA可渗进细胞，但有时也会使细胞受到严重损伤。②显微注射法：显微注射（microinjection）是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。此法用于生殖细胞时，有效率可达10% 。直接用于体细胞却很困难。在动物实验中，套用这种方法将目的基因注入生殖细胞，使之表达而传代，这样的动物就称为转基因动物，如今成功使用得较多的是转基因小鼠（transgenic mice），它可作为繁殖大量后代的疾病动物模型。③脂质体法：脂质体（liposome）法是套用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，使之表达。3）同源重组法：同源重组（homologous recombination）是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上，在该座位因有同源序列，通过单一或双交换，新基因片段替换有缺陷的片段，达到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁组装一Neo基因，则在同源重组后，因有Neo基因，可在含有新霉素（neomycin）的培养基中生长，从而使未插入新基因片段的细胞死亡。对于体细胞基因治疗，体外培养细胞的时间不能过长，筛选量大，故在临床上套用也受限制难以进行。今后如能改进技术，提高重组率，这种定点修正基因的方法仍是有前景的。4）病毒介导基因转移：前述的化学和物理方法都是通过传染方式基因转移。病毒介导基因转移（viral mediatedgene transfer）是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体（vector），将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体（viral vector）。如今套用的有两种病毒介导基因转移方法。①反转录病毒载体：反转录病毒虽是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。反转录病毒载体有以下的优点首先是具有穿透细胞的能力，可使近100%的受体细胞被感染，转化细胞效率高；其次，它能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性；再者随机整俣的病毒可长期存留，一般无害于细胞，但也存在缺点：这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞，如神经元。最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。因此，人们有目的地将病毒基因及其癌基因除去，仅留它们的外壳蛋白，以保留其穿透细胞的功能，试图避免上述缺点。这种改造后的病毒称为缺陷型病毒（defective virus）。这样的病毒中的反转录酶可将RNA转化为DNA，有助于该DNA顺利进入宿主细胞的基因组，而该病毒则死亡。由于病毒整合基因组是随机的，所以还是可能激活细胞的原癌基因，以及因随机插入发生插入突变。在反转录病毒载体中，最常用于人类的是莫洛尼（Mooney）鼠白血病病毒（murine leukemia virus;Mo-MLV），其人工构建的结构。②DNA病毒介导载体（DNA viral mekiated vector）：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等，一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒。牛乳头瘤病毒重组后，可不插入宿主染色体中引起插入突变，又可在宿主染色体外独立複製，并表达出基因产物。有人发现，因缺少E1区而致複製缺陷的腺病毒，可在表达E1基因的细胞中繁殖。后来证明，载有外源DNA的複製缺陷腺病毒呈现相同繁殖的特点。1993年美法等国成功採用腺病毒载体进行心、脑、肺、肝内胆管和肌肉组织的体内基因转移。它代表了基因治疗的新方向。美国设计了一个新的腺病症载体，它是用一个化学连线器即赖氨酸链（lysine chain）将DNA栓在病毒外壳上，这样组成的运输器，通过一个表面抗体而进入细胞核，使宿主基因与治疗基因共同表达。这个新病毒载体称为腺病毒多赖氨酸DNA複合体（adeno virus-polylysine DNA-complex）。採用複製缺陷的腺病毒进行基因治疗有以下优点：①该病毒可感染分裂和非分裂的细胞，并能得到大量基因产物，对神经细胞、心肌细胞等基因缺陷的纠正有特殊意义；②病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩，且感染力不降低；③可有效转导多种靶细胞后而少游离于细胞基因组外，并持续表达；④已用于基因治疗的Ad5属腺病毒C亚群，无致癌性。前述的新腺病毒载体还有一大优点是可以成功地运载48000bp的基因，而其它病毒只能运输70 00bp的基因。这些优点显示了腺病毒介导载体的广阔套用前景。2．选择靶细胞的原则这里所指的靶细胞是指接受转移基因的体细胞。选择靶细胞的原则是：①必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内；②具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；③易于受外源遗传物质的转化；④在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。许多遗传病与造血细胞有关，故可用于如β地贫、严重複合免疫缺陷病等的基因治疗。皮肤成纤维细胞易于移植和从体内分离，又可在培养中生长，并易存活，故有人用之于乙型血友病的基因治疗。有不少遗传病表现了肝细胞功能缺陷，因此，在家族性高胆固醇血症的治疗中，有将低密度脂蛋白（LDL）受体基因转移至肝细胞的尝试。在动物实验中已证明：β－半乳糖苷酶基因、ADA基因、小肌营养不良蛋白（minidystrophin）基因都已证明能在肌细胞中表达。基本程式(一)治疗性基因的获得

医学术语 基因治疗( 二 )

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