无血清培养基 _生活百科

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无血清培养基【无血清培养基】无血清培养基和试剂被广泛的套用于培养哺乳动物和无脊椎动物细胞以製备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。大多数的无血清培养基含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质和清蛋白，纤维蛋白，胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同的功能，如提供细胞贴壁所需的基质，抗生物反应器剪下力，作为脂质和其他生长分化因子的载体等。
基本介绍中文名：无血清培养基
添加组分：促贴壁物质、促生长因子及激素等
优点：有利于体外培养细胞的分化
缺点：成本较高
定义无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物製药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。添加组分1.促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。2.促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。3.酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。4.结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。5.微量元素：硒是最常见的。使用方法目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：1.处于对数生长中期2.>90% 活细胞率3.适应时以较高的起始细胞接种细胞适应无血清培养基的方法1.直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该:2.5×10~3.5×10细胞/ml 。当细胞密度达到1×10~3×10细胞/ml时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×10~4×10细胞/ml时，细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天，当细胞密度达到1×10~3×10细胞/ml，细胞活率在90%时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。2.连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。（1）以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25%SFM 混合培养基中，传代培养。（2）当细胞密度>5×10细胞/ml时，以2×10到3×10细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。（3）以2×10到3×10细胞/ml细胞密度，25%有血清培养基和75% SFM中传代培养。（4）当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml（接种后4到6天），在100%SFM培养基中传代培养。（5）每隔3到5天，当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml，细胞活率在90%时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。细胞培养适应替代血清：许多细胞利用连续适应方法能很好的适应，用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1（v∶v）的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100%替代培养基。每次适应改变血清比例时，传代细胞2到3次。培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。特别需要强调的是：配製无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置製备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。无血清培养基的优点1.可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重複性。2.避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。3.避免血清组分对实验研究的影响。4.有利于体外培养细胞的分化。5.可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。缺点：1.细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和套用不如传统的合成培养基方便。2.成本较高。3.针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。无血清培养基一些配方1.神经细胞，干细胞，PC12细胞成份终浓度葡萄糖－－0.6%谷氨醯胺－2mMNaHCO3－－3mMHepes －－5mM胰岛素－－2.5μg/ml转铁蛋白－100ng/ml孕酮－－20nM丁二胺－－60μM硒酸钠－－30nM青霉素－－50mg/ml 链霉素－－50mg/ml最后用DF12添加到100ml即可2.各类小鼠胚胎癌细胞系培养基DMEM/F12 1:1混合成1000mlNaHCO32.4gHEPES(1.5M) 10.0ul硒酸（5*10-6M) 10.0ug纤粘连蛋白 1ug/cm(37度作用15－30分钟）胰岛素 1000.0ug转铁蛋白 5000.0ug3.NIH3T3小鼠成纤维细胞培养基DMEM/F12 1:1混合成1000mlHEPES 15mM大豆胰酶抑制剂 0.1%胰岛素 10.0ug/ml转铁蛋白 25.0ug/ml纤粘连蛋白 5.0ug/ml4.杂交瘤细胞培养基DMEM/F12 1:1混合成1000mlNaHCO31.2g/LHEPES 15mM胰岛素 5.0ug/ml氨基乙醇 20.0uM硒酸 2.5mM转铁蛋白 35.5ug/ml套用：无血清培养基和试剂被广泛的套用于培养哺乳动物和无脊动物细胞以製备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。大多数的无血清产品含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质如清蛋白，纤连蛋白，胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反应器剪下力，提供细胞贴壁所需的基质，作为脂类和其他生长因子的载体等。无血清培养基的种类