吴小兵名字打多少分,刘汉案件里的吴小兵犯啥罪( 五 ) _没有签订劳动合同

是由两种以上的组成因素组成的生产系统。传统的AAV载体生产系统就是由载体质粒，辅助质粒，辅助病毒和生产细胞4种因素组成。这种策略的缺点是影响因素多，操作复杂，产量不容易稳定，不利于大规模生产。以上各种生产系统也可以相互转化。我们实验室通过将上述AAV载体生产系统的4种因素进行两两合并，即将辅助质粒和辅助病毒合并成一种重组的辅助病毒，将载体质粒和生产细胞合并成AAV前病毒细胞株，成功地将其转化成一种双组成因素的新型高效生产系统（伍志坚等，1999）。
一般来说，发展新的包装策略主要是为了以下几种目的：
（1）减少生产系统中的组成因素，简化操作过程；
（2）提高生产效率，降低生产成本；
（3）避免或降低野生型病毒的产生；
（4）避免使用难以与产品病毒分离的辅助病毒。
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第三节病毒载体的纯化方法
重组病毒的纯化与基因工程产品的纯化既有许多共性，又有显著的不同之处。病毒可以看作是一个具有特定结构的生物大分子，一般都由位于中心的核酸和包裹于其外的蛋白外壳组成。有些病毒还具有脂质膜和糖蛋白或糖脂。许多分离纯化蛋白质的方法如离心和梯度离心、盐析、柱层析、超滤、透析等方法都可用于病毒的纯化。然而，由于病毒结构的复杂性，纯化时不能采用蛋白质变性和复性的方法，因为一旦病毒蛋白发生变性，或病毒结构发生破坏，在体外就很难再重建成有感染性的病毒颗粒。因此，在病毒的纯化过程中必须保持病毒的结构不受破坏，并且监测其感染活性。
病毒的纯化一般分为以下几个步骤：
初始物（start material）的收集或制备
根据病毒产生方式的不同而采取不同的方式。对于不导致细胞病变和死亡的病毒如反转录病毒，可不断收集产毒细胞（VPC细胞）的培养上清作为初始物；对于在生产病毒过程中宿主细胞发生病变和死亡的病毒如腺病毒，在病毒产生达到高峰时，收集培养上清，并裂解细胞以释放细胞内的病毒。
培养上清和细胞裂解液都可作为纯化的初始物。在实验室的小规模制备中，往往采用将培养上清与细胞一起反复冻融3～4次的方法制备细胞裂解液作为初始物。对于初始物体积大于500ml的较大规模的制备，则需要考虑采用不同初始物的损益率。如果收集时大部分（90％以上）目标病毒仍存在于细胞中，为了减少操作大体积初始物带来的不便，可以考虑放弃上清中含有的目标病毒，而通过低速离心收集细胞，重悬于较小体积的缓冲液中进行细胞裂解制备细胞裂解液。对于腺病毒和AAV病毒的大规模制备都可以采用这种方式。如果通过延长培养时间可以使大部分的目标病毒释放到培养液中，也可以只收集培养上清而弃去细胞，从而省去反复冻融的步骤。
除了用反复冻融方法裂解细胞外，还可以根据目标病毒的生物学性质采用其它不影响其感染性的方法，如超声法、化学法（如在AAV病毒制备中用脱氧胆酸或氯仿）等。
初始物的浓缩
当初始物体积较大时，要考虑对其进行浓缩后再分离纯化。浓缩时最好同时能获得初步纯化对于效果。在不影响目标病毒的感染性的前提下，可选用盐析、超滤、透析等方法进行浓缩。盐析法不仅可以用来浓缩初始物，同时也能达到一定的分离纯化效果。最常用的盐是硫酸铵；许多病毒如腺病毒、AAV病毒和单纯疱疹病毒用聚乙二醇/氯化钠系统沉淀可获得很好的效果并且不影响病毒的感染性。
目标病毒的分离纯化
氯化铯密度梯度离心法至今仍是分离纯化各种病毒的最常用方法。主要是依据不同病毒具有特征性的浮力密度，使其与细胞裂解液中的其它成分分离开来。收集到目标病毒特异的组分后，用透析法除去其中的氯化铯，获得纯化的病毒。用这种方法有时可获得极高纯度的病毒。目前在临床实验中应用的重组腺病毒大都是用这种方法进行纯化的。然而，这种方法也存在明显的弊病，主要是费时且操作难度较大，重复性较差；并且氯化铯对人体有毒性。因此随着基因治疗研究和应用的发展，用这种方法纯化的重组病毒可能不能适应人体内应用的要求。